О разных типах создания анаэробной атмосферы

Подвиды Campylobacter являются основной причиной болезней пищевого происхождения и для роста требуют микроаэрофильные условия (3–15% O2 и 3–5% CO2). Некоторые штаммы способны расти в аэробных условиях (21% O2). Оптимальный диапазон для термофильных видов Campylobacter: от 5 до 10% O2 и от 1 до 10% CO2, что аналогично оптимальному диапазону Campylobacter jejuni. До дифференциации, проведенной Зебальдом и Верноном в 1963 году, Campylobacter первоначально входили в род Vibrio, факультативно-анаэробные бактерии. Микроаэрофильные требования и несахаролитический метаболизм видов Campylobacter отличают их от Vibrio spp. 

Хотя разработка и применение систем создания и поддержания анаэробной среды ведется примерно с конца 1800-х годов, исследований строго микроаэрофильных среды  для роста  Campylobacter проводилось мало. Это может быть связано с тем, что анаэробные и микроаэрофильные потребности в чем-то схожи; однако между этими двумя средами существуют небольшие различия. В ранних исследованиях ученые оценивали различные системы создания микроаэрофильной среды, но они не изучали характеристики роста Campylobacter jejuni, которая является наиболее распространенным штаммом Campylobacter, связанным с домашней птицей. Поскольку Campylobacter признана основной причиной болезней пищевого происхождения и, в частности, Campylobacter jejuni тесно связана с продуктами птицеводства, необходимо понимать, какая из имеющихся систем является наиболее надежной и эффективной для создания подходящей микроаэрофильной среды для роста бактерии.

Быстрое создание атмосферы с очень низким уровнем кислорода имеет решающее значение для выращивания как анаэробных, так и микроаэрофильных бактерий.  В середине 1800-х годов Пастер, а также Ненки первыми применили вакуумирование кислорода из окружающей среды, что является одним из самых ранних методов создания особой атмосферы. Ранее использовались различные формы вакуумных насосов, в том числе ртутные и водяные аспираторы, а также механические воздушные насосы. Пропускание инертных газов через среду с целью удаления кислорода из окружающей среды также использовалось на ранних этапах для создания анаэробной атмосферы. В 1886 году Либрориус был одним из первых, кто объединил откачку кислорода с газообразным водородом в контейнере, похожем на банку. Контейнер имел впускные и выпускные отверстия из резиновых трубок для обеспечения атмосферы, а также краны для предотвращения утечки газа.  В 1890 году Боткин включил в него стойку для хранения чашечных культур. Устройство анаэростата со съемной крышкой было впервые описано в 1893 году и больше похоже на анаэростаты, используемые сегодня в лабораториях.

С момента разработки первых анаэростатов стало доступно несколько модифицированных контейнеров и технологий для создания как анаэробной, так и микроаэрофильной среды. Так, например, Флетчер и Пластридж  использовали методы, разработанные Виссом и Сполдингом, чтобы создать особую атмосферу для микроаэрофильных видов вибрионов, включая плод вибрионов. Анаэростат Висса-Сполдинга (10 чашек Петри на банку) соединяли с вакуумным насосом и вакуумировали 3 раза. После третьего раза банки наполнились 10% углекислого газа и 90% водорода. В 1979 году были предложены два альтернативных метода (автоклавная лента и пакеты для хранения Ziploc) для выращивания Campylobacter spp. были основаны на принципе Фортнера и протестированы. В этом исследовании факультативный анаэроб Proteus rettgeri использовался для снижения напряжения кислорода в атмосфере и стимулирования роста Campylobacter. Результаты показали, что этот метод позволяет Campylobacter расти как с помощью автоклавной ленты, так и с помощью пакетов для хранения Ziploc. Розенблатт и Стюарт (1975) исследовали методы создания анаэробной среды с использованием анаэробных пакетов и контейнеров Gaspak. Их результаты показали, что оба метода были успешными в размножении микробов, но не было существенной разницы в выходе анаэробов. В 1982 году была оценена эффективность системы CampyPak II по выделению Campylobacter fetus ssp. jejuni из клинических образцов. Система оболочки содержала водородный катализатор, который снижал уровень кислорода до уровня микроаэрофильной среды. Они обнаружили, что эффективность системы CampyPak II идентична методу вакуумирования банки.

В 1984 году была разработана автоматизированная система вакуумирования контейнеров Anoxomat, которая изменила способ создания анаэробной и микроаэрофильной среды. Эта система автоматически откачивала воздух из банок и заменяла его газовой смесью с помощью насоса. Система Anoxomat была оценена как быстрая, простая в использовании и надежная. Были проведены исследования  по сравнению роста и восстановлению анаэробных бактерий в системе Anoxomat с системой анаэробных камер и системой GasPak, которая аналогична системе CampyPak II. Все эти системы были сопоставимы друг с другом, каждая имела степень восстановления бактерий выше 88% для 108 протестированных изолятов.

Автоматизированная подача газа, газогенерирующие пакеты и пластиковые пакеты для хранения — три наиболее часто используемых метода создания микроаэрофильной атмосферы в лабораториях сегодня. Учитывая небольшое количество исследований, посвященных строгому сравнению методов создания микроаэрофильной среды, было проведено  исследование, которое дает  представление о лучших практиках создания стабильной и эффективной микроаэрофильной атмосферы для роста Campylobacter jejuni. Целью исследования было оценить системы автоматической подачи газа, газогенерирующих пакетиков и пластиковых пакетов для хранения, а также определить, является ли одна система более надежной или эффективной при культивировании Campylobacter jejuni, чем другие.

В ходе исследования чистую культуру Campylobacter jejuni  ATCC, хранившуюся на гранулах Cryosaver Brucella, извлекали из вертикального морозильника Revco Ultima, и 3 защитных шарика помещали в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 12 мл бульона для бруцелл. Согласно предварительному исследованию, такое соотношение шариков и бульона обеспечивало примерно от 50 до 100 КОЕ на чашку. Пробирку перемешивали в течение 1 минуты с помощью вортекса. Сто микролитров суспензии распределяли по 36  чашкам и помещали в каждый из 3 различных контейнеров для обработки для оценки доставки газа. Для образцов системы автоматической подачи газа и пластиковых пакетов для хранения планшеты помещали в анаэростат или мешок для хранения с двойной защитой Ziploc  соответственно. Затем чашки продували микроаэрофильной газовой смесью (80% N2, 10% CO2, 5% H2 и 5% O2) с использованием системы Anoxomat Mart II для образцов автоматизированной системы или непосредственно из заранее приготовленной смеси из резервуара для образцов пластиковых пакетов для хранения. Для образцов в пакетиках чашки помещали в анаэростат и открывали и помещали в контейнер 3 пакетика Gaspak. Все чашки помещали в термостат  при 42°C на 24 часа. Через 24 ч чашки вынимали из инкубатора и подсчитывали количество колоний. Весь эксперимент был повторен в общей сложности 5 раз.

Три широко используемых метода создания атмосферы были оценены на предмет надежности и эффективности для роста Campylobacter jejuni. Всего было исследовано 540 чашек с образцами на предмет среднего количества колоний для трех систем подачи газа, и между системами не было обнаружено существенных различий. Кроме того, CV были одинаковыми для каждого из протестированных методов доставки газа, что указывает на то, что различия в количестве колоний между чашками были одинаковыми для каждого метода. Было также показано, что размер колонии также мог зависеть от продолжительности инкубации. Результаты более раннего исследования показали, что C. fetus ssp. jejuni слишком малы для точного измерения обоими методами через 24 часа. Однако через 48 часов колонии ученые не выявили статистических различий в размерах роста между колониями.

В заключение можно сказать, что все три системы смогли обеспечить надежную микроаэрофильную среду для роста чистой культуры Campylobacter jejuni. В работе при выборе метода необходимо учитывать два фактора: пространство и стоимость. Первоначальная стоимость автоматизированной системы подачи газа высока, но долгосрочные затраты относительно невелики. Хотя газогенерирующие пакетики не очень дороги, для них все же требуется тот же тип анаэростатов, что и для автоматизированной системы подачи газа. Система пластиковых пакетов для хранения является самой дешевой из трех. Что касается места, важно учитывать вместимость чашек и доступность инкубатора. Анаэростаты  для систем автоматической подачи газа и газогенерирующих пакетиков могут вмещать до 36 чашек, тогда как система пластиковых пакетов для хранения может вмещать максимум 16. Автоматизированная система подачи газа также требует больше всего места на столе; однако все три метода требуют примерно одинакового места в инкубаторе. Поэтому при определении наиболее экономичной системы для лаборатории следует учитывать стоимость оборудования автоматизированной системы подачи газа по сравнению со стоимостью газогенерирующих пакетов.