О Токсин А-отрицательных, токсин В-положительных Clostridium difficile

Токсин А-отрицательный, токсин В-положительный Clostridium difficile

Clostridium difficile — распространенный внутрибольничный патоген и основная причина инфекционной диареи у госпитализированных пациентов. Колонизация C. difficile связана с широким спектром клинических проявлений: от бессимптомного носительства до молниеносного псевдомембранозного колита. В последние годы заболеваемость C. difficile и количество случаев, связанных с тяжелыми исходами, возросли во всем мире.

Это может быть связано с несколькими факторами, включая изменение демографических характеристик пациентов, поступающих в больницу, изменение политики инфекционного контроля или появление более вирулентных штаммов C. difficile.

Два структурно схожих токсина, обозначенные как TcdA (308 кДа) и TcdB (270 кДа), являются основными детерминантами вирулентности, связанными с заболеванием, связанным с Clostridium difficile (CDAD), и большинство патогенных штаммов C. difficile продуцируют оба токсина (A+B+). Оба этих крупных токсина являются глюкозилтрансферазами, которые катализируют моноглюкозилирование треонина 35/37 малых ГТФ-связывающих белков Rho, Racи Cdc42 в клетках-мишенях и, таким образом, модулируют несколько физиологических клеточных событий, приводящих к гибели клеток. Структурно эти токсины имеют три домена: ферментативная активность локализована в N-конце белка, средний домен является предполагаемой областью транслокации, а C-конец участвует в связывании рецептора. N-концы TcdA и TcdB демонстрируют 74% гомологии, что объясняет их схожую субстратную специфичность. Карбокси-концевой домен обоих токсинов несет ряд коротких гомологичных участков, называемых комбинированными повторяющимися олигопептидами (CROP).

Роль этих токсинов в патогенезе CDAD хорошо описана. Оба токсина, A и B, являются провоспалительными, цитотоксическими и энтеротоксичными в толстой кишке человека. Эти токсины кодируются двумя генами tcdA и tcdB, отображающимися в локусе патогенности размером 19,6 кб (PaLoc), содержащем дополнительные регуляторные гены. Были исследованы изоляты C. difficile с различными генетическими модификациями в PaLoc, и было описано 28 различных токсинотипов. К ним относятся вариант C. difficile, имеющий делеции, вставки или полиморфные сайты рестрикции в одном или нескольких генах PaLoc, но который все еще может продуцировать функциональные токсинные белки TcdA и TcdB, а также штаммы токсин-вариантов (A−B+), которые не продуцируют обнаруживаемый токсин A. Штаммы токсин-вариантов, которые продуцируют либо токсин A, либо токсин B, являются наиболее часто выделяемым вариантом C. difficile с модификациями в их PaLoc. До недавнего времени считалось, что все токсигенные штаммы, связанные с заболеванием, продуцируют как TcdA, так и TcdB. Ранние исследования на животных моделях показали, что TcdA и TcdB действуют синергически, но для первоначального повреждения в толстой кишке требуется TcdA. Следовательно, большая часть исследований патогенеза CDAD была сосредоточена на воспалении, модулируемом токсином A. Однако многие недавние отчеты демонстрируют клиническую значимость A-отрицательных токсин B-положительных (A−B+) изолятов. Вспышки диареи C. difficile, спорадические случаи инфекции и случаи псевдомембранозного колита (ПМК), вызванные A−B+C. difficile, были ранее задокументированы.

A−B+Clostridium difficile

На сегодняшний день четыре различных штамма Clostridium difficile A−B+ были описаны и охарактеризованы с использованием схемы токсинотипирования Рупника (ПЦР-ПДРФ). В начале 1990-х годов были идентифицированы два типа штамма A−B+, которые продуцировали TcdB, но не обнаруживали TcdA. Штамм 8864, первый штамм токсинового варианта, который был охарактеризован, вызывал кровотечение, накопление жидкости и повреждение тканей в лигированных петлях подвздошной кишки кролика. Молекулярный анализ выявил большую делецию 5,9 кб в картировании PaLoc на 3′ конце tcdA и tcdC, что предотвратило продукцию TcdA на транскрипционном уровне. Кроме того, между tcdA и tcdE имеется вставка 1,1 кб. Токсинотипирование обозначает этот тип штамма как токсинотип X. Ранние исследования показали, что этот тип штамма продуцировал модифицированную форму TcdB, а последующие анализы определили, что TcdB-8864 вызывал другой цитопатический эффект (CPE) по сравнению с TcdB-10463 (TcdB-8864 глюкозилирует белки Rho Rac1, Rap 1/2 и Ral). Только один организм штамма типа 8864 был когда-либо изолирован (от бессимптомного взрослого человека), и, хотя клиническая значимость этого штамма у людей сомнительна, его вирулентность в животных моделях подтверждает его патогенный потенциал.

Вторая категория выявленных типов штаммов A−B+ включала штаммы серогруппы F(штамм типа 1470), которые считались непатогенными из-за их частой изоляции от бессимптомных младенцев и отсутствия патогенности в моделях животных. Как и штамм 8864, они также усечены в 3′-области повторяющегося домена tcdA. Они содержат делецию размером 1,8 кб в tcdA вместе с мутацией, которая вводит стоп-кодон, соответствующий аминокислотной позиции 47, что приводит к усечению TcdA-1470. Токсинотипирование классифицировало эти организмы как тип VIII. Анализ TcdB-1470 показал, что этот токсин также имеет полиморфизмы в своем гене tcdB, что приводит к измененному глюкозилированию и дифференциальным цитопатическим эффектам. Анализ последовательности TcdB из штаммов 8864 и 1470 показал высокую степень консервации последовательности в ферментативном домене с заменами только в 8 из 560 позиций аминокислот. Эти новые цитотоксины являются гибридом между TcdB из эталонного штамма VPI 10463 и летальным токсином Clostridium sordellii (TclS). В то время как домен связывания рецептора разделяет 100% гомологию с TcdB-10463, ферментативный домен гомологичен только на 79%. Эти гибридные токсины предполагают, что генетический обмен и рекомбинация могли произойти между крупными штаммами клостридий, продуцирующими клостридиальный токсин (LCT).

Совсем недавно были описаны два дополнительных штамма A−B+, токсинотипы XVI и XVII. Интересно, что эти новые токсинотипы содержат гены, кодирующие бинарный токсин Clostridium difficile. Молекулярный механизм, ответственный за отсутствие продукции токсина Aв этих новых токсинотипах, еще не описан, хотя эти штаммы также имеют делеции в области CROP tcdA. Хотя было описано четыре типа штамма A−B+, токсинотип VIII, по-видимому, является наиболее клинически значимым типом штамма токсинового варианта. Они были выделены из четырех задокументированных вспышек, спорадических случаев диареи и случаев псевдомембранозного колита. Напротив, только один штамм токсинотипа XVI был связан с клиническим заболеванием, а два других токсинотипа X и XVII были выделены у бессимптомных пациентов.

Вспышки A−B+Clostridium difficile

На сегодняшний день было зафиксировано четыре вспышки, связанных с A−B+Clostridium difficile. Первая вспышка, о которой сообщили в 1998 году Альфа и др., произошла в канадской больнице в течение трех месяцев. Было зарегистрировано 16 случаев нозокомиальной диареи C. difficile в четырех больничных палатах; восемь из них провели время в одной больничной палате. Эта вспышка была связана с 19%-ным уровнем рецидива CDAD и двумя смертельными исходами. После вспышки политика контроля инфекций в больнице была изменена, и лабораторное тестирование на C. difficile было изменено с ELISA на токсин A, который не смог обнаружить эти штаммы A−B+, на анализ цитотоксичности клеточной культуры. Вторая вспышка A−B+ произошла в Нидерландах между 1997 и 1998 годами. В этой вспышке было выявлено 24 пациента с A−B+C. difficile. Частота рецидивов в этой вспышке составила 13%, при этом было семь эпизодов тяжелой диареи и один летальный исход. Клональность 16 имеющихся изолятов вспышки была определена с помощью риботипирования 16–23S рРНК. Эта вспышка утихла после изменения политики хирургической профилактической антибиотикотерапии, в результате чего клиндамицин был отменен, а также после введения стратегических мер инфекционного контроля. В 2001 году в онкологической больнице в Японии было выявлено 10 пациентов с идентичными штаммами A−B+C. difficile. Недавно наша группа описала вспышку A−B+C. difficile в одной из больниц Дублина, которая затронула 73 пациента (Drudy et al., подано в печать). Молекулярное типирование 90 выделенных изолятов показало, что 95% изолятов были A−B+ (ПЦР-риботип 017, токсинотип VIII).

Спектр заболеваний и заразность A−B+Clostridium difficile

A−B+Clostridium difficile вызывает тот же спектр заболеваний, который связан со штаммами A+B+, от бессимптомной колонизации до более тяжелого молниеносного колита. Частота рецидивов C. difficile, наблюдавшаяся в нашем исследовании (36%) и других вспышках, вызванных штаммами с токсиновыми вариантами, аналогична частотам рецидивов, о которых сообщали мы и другие исследователи для штаммов с токсинами A+B+. Однако вспышки, описанные нами и другими авторами, задокументировали повышенную тяжесть заболевания, связанную с этими изолятами A−B+. Механизм(ы), ответственные за это наблюдаемое повышение тяжести заболевания, неизвестны. Ранее мы продемонстрировали, что иммунный ответ на токсин A важен для определения клинической картины и течения CDAD. Недавние исследования in vitro показали, что, как и TcdA, TcdB также является мощным энтеротоксином, способным вызывать в 10 раз большую токсичность в эксплантатах толстой кишки человека, чем токсин A. Уорни и коллеги продемонстрировали, что возникающие эпидемические клоны A+B+ продуцируют в 23 раза больше TcdB и в 16 раз больше TcdA по сравнению со штаммами токсинотипа 0. Хотя кинетика продукции токсина B в изолятах A−B+ еще не была измерена, эти штаммы не продуцируют токсин A, и поэтому патология, наблюдаемая в случаях тяжелого колита, вероятно, является результатом воспалительных событий хозяина, модулируемых TcdB. Эти результаты дополняют растущее число исследований, которые подчеркивают важность токсина B в патогенезе CDAD.

Механизмы внутрибольничного приобретения, персистенции и передачи Clostridium difficile сложны и не полностью изучены для всех типов штаммов. Другие исследователи определили, что большая споруляция и способность к прорастанию спор наряду с повышенной устойчивостью к противомикробным препаратам могут способствовать персистенции клональных изолятов A+B+ в нозокомиальных условиях. Механизмы, посредством которых сохраняются штаммы A−B+, широко не изучались. Однако повышенная устойчивость к макролидам, линкозамидам и стрептограмину (MLS) и фторхинолонам, наблюдаемая в наших вспышках изолятов, вероятно, способствует персистенции как в больничной среде, так и в кишечнике человека. Текущее наблюдение в нашей больнице указывает на персистенцию этого штамма, хотя уровень заболеваемости остается низким. Наблюдение после вспышки в Нидерландах показало, что их изоляты A−B+ не сохранялись. Эти штаммы A−B+ больше не обнаруживаются у пациентов в этом учреждении (E. Kuiper, личное сообщение).

Устойчивость к антибиотикам у A−B+Clostridium difficile

Раннее исследование Дельме и Авесани показало, что штаммы серогруппы F (A−B+) обычно были восприимчивы к клиндамицину и эритромицину. С тех пор было задокументировано возникновение резистентности к антибиотикам MLS. Шестнадцать изолятов A−B+ из вспышки в Нидерландах были исследованы на устойчивость к антибиотикам, и все они были устойчивы к клиндамицину, эритромицину и тетрациклину и содержали ген ermB, который кодировал устойчивость к MLS. Изоляты из вспышек в Канаде и Японии не были проверены на чувствительность к антибиотикам. Изоляты A−B+ из нашей больницы также были устойчивы к антибиотикам MLS и содержали ген ermB. Кроме того, наши штаммы A−B+ были устойчивы к ряду новых классов фторхинолонов, включая ципрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин. Насколько нам известно, это первое описание устойчивости к фторхинолонам у этого типа штамма A−B+. Питух и др. описали появление клона A−B+ C. difficile, устойчивого к клиндамицину, в польских больницах. Поскольку C. difficile обычно не культивируется во многих больничных лабораториях, истинная частота антимикробной резистентности среди C. difficile неизвестна. Текущее перспективное исследование, проведенное Европейской группой по изучению C. difficile, изучает антимикробную резистентность C. difficileи предоставит данные относительно антибиотикорезистентности у A−B+ и других типов штаммов C. difficile.

Распространенность A−B+Clostridium difficile

Эти штаммы токсиновых вариантов были выделены из нескольких стран с различными показателями распространенности. Например, показатели 0,2% были зарегистрированы в многоцентровом исследовании в США, где 2 из 102 изолятов Clostridium difficile из шести клинических учреждений были A−B+. В Великобритании показатели распространенности 3% были описаны для 43 изолятов из 9 из 35 больниц, которые предоставили штаммы для типирования в Анаэробную референтную лабораторию в Кардиффе. Во Франции были зарегистрированы показатели 3% из 25 различных больниц в Париже. Напротив, в одном японском исследовании были описаны показатели распространенности A−B+, достигающие 39%. Кроме того, недавнее исследование в Израиле задокументировало показатели A−B+C. difficile в размере 56%. Недавнее исследование в Аргентине показало, что штаммы A−B+ полностью заменили штаммы A+B+ за четырехлетний период, при этом количество изолятов A−B+ увеличилось с 12,5% в 2000 году до 97,9% в 2003 году.

Лабораторная диагностика A−B+Clostridium difficile

Большинство лабораторных диагностических тестов на Clostridium difficile основаны либо на фекальной культуре, либо на прямом обнаружении токсина в фекальных образцах. Анализ цитотоксичности клеточной культуры считается золотым стандартом для обнаружения токсина и может обнаружить пикограммовые количества токсина через 48 часов. Кроме того, клеточная культура может идентифицировать эти штаммы A−B+ из-за различного CPE, вызванного этими штаммами в результате их различной специфичности субстрата глюкозилтрансферазы. Иммуноферментные анализы (ИФА), которые могут обнаружить либо TcdA, либо TcdB, являются наиболее часто используемым диагностическим подходом из-за их простоты использования и быстрого времени выполнения, хотя эти методы менее чувствительны по сравнению с анализом цитотоксичности. Специфические ИФА токсина А используют антитела, нацеленные на область CROP tcdA, которая удалена в типах штаммов A−B+, которые поэтому не реагируют в этих анализах. Недавнее исследование, проведенное исследовательской группой Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (ESCMID) по C. difficile, показало, что среди европейских лабораторий, проводящих обнаружение токсина C. difficile, 58% использовали ИФА, которые могут обнаруживать только токсин A, и поэтому штаммы токсина A−B+ не будут обнаружены в этих клинических условиях. Неиспользование стандартизированных методов диагностики C. difficile, которые включают как токсин A, так и B, может привести к значительному занижению данных о C. difficile. Культура C. difficile не обладает специфичностью из-за присутствия нетоксигенных изолятов и занимает 48 часов. Однако культура является единственным способом типирования штаммов и тестирования на антимикробную чувствительность и, следовательно, единственным способом, с помощью которого можно идентифицировать и контролировать возникновение и распространение более вирулентных или резистентных штаммов.

Молекулярный анализ A−B+Clostridium difficile

Несколько различных методов молекулярного типирования были применены к вариантам A−B+, включая анализ эндонуклеазы рестрикции (REA), риботипирование 16–23S рРНК, полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP), мультилокусное типирование последовательностей (MLST) и токсинотипирование (PCR-RFLP). Недавнее исследование Lemee et al. применило MLST к 72 изолятам C. difficile от различных хозяев, географических местоположений, риботипов ПЦР и токсигенных типов. Изоляты исследования включали восемь изолятов A−B+ из США, Японии и Франции, культивированных от взрослых и детей людей. Все восемь изолятов принадлежали к одному и тому же типу последовательности и группировались в очень однородной филогенетической линии MLST, несмотря на их происхождение от неродственных пациентов. Более того, нулевой аллель для одного из семи исследованных генов домашнего хозяйства дополнительно подтвердил низкое генетическое разнообразие этих типов A−B+. Ван ден Берг и др. использовали AFLP и риботипирование 16–23S рРНК для анализа 39 штаммов A−B+ из семи разных стран. AFLP распознал два генотипа среди 39 изолятов, в то время как два разных метода риботипирования могли дифференцировать два и три риботипа ПЦР соответственно. Все три метода продемонстрировали схожую дискриминационную способность при типировании типов штаммов A−B+.

В одном международном исследовании сравнивали родство 23 штаммов A−B+ с использованием трех методов типирования: серогруппирование, риботипирование ПЦР 16–23SрРНК и REA. Это исследование задокументировало высокую степень сходства между штаммами A−B+ из США и Европы. Двадцать один из 23 изолятов имел делецию 1,8 кб на 3′ конце tcdA, соответствующую токсинотипу VIII, и 20 из 21 исследованных имели риботип ПЦР 017. REAбыл наиболее дискриминационным методом типирования, различающим 11 типов REA среди 23 изолятов. Этот метод мог далее подтипировать 20 штаммов ПЦР 017/серогруппы F на шесть различных типов REA. Риботипирование ПЦР и серогруппирование идентифицировали четыре и три различных типа соответственно. Оставшиеся два штамма A−B+, исследованные в этом международном исследовании, были штаммом 8864, который был уникальным с использованием всех трех методов типирования. Кроме того, штамм ПЦР риботип 110/серогруппа X/REA DA1 имел тот же генотип токсина, что и VPI 10463, но не продуцировал токсин A in vitro.

Заключительные замечания

Встреча штаммов Clostridium difficile A−B+, по-видимому, растет во всем мире. Эти типы штаммов в настоящее время представляют собой значительное количество изолятов C. difficile. Эти изоляты могут быть недооценены из-за широкого использования диагностических средств, которые обнаруживают только TcdA. Хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, отличается ли патогенез варианта токсина CDAD (A−B+) от патогенеза штаммов токсина A+B+, клиницисты должны знать о риске тяжелого заболевания, связанного с этими вариантными типами штаммов. TcdB, вероятно, играет более заметную роль в патогенезе C. difficile, чем считалось ранее, и будущая работа должна быть сосредоточена на экспрессии и регуляции этого токсина, а также на модуляции иммунного ответа хозяина. Однако отсутствие подходящих генетических инструментов для манипулирования C. difficile и отсутствие изогенных мутантов может помешать прогрессу. Новые терапевтические подходы к лечению CDAD, такие как препараты, связывающие токсины, пассивная иммунотерапия или активная иммунизация посредством вакцинации, теперь должны быть нацелены как на TcdA, так и на TcdB.