Диско-диффузионный метод: практическое руководство по рекомендациям МАКМАХ 2024-02

Диско-диффузионный метод остаётся основным способом определения чувствительности в практических бактериологических лабораториях: он применим к большинству возбудителей, универсален для широкого круга препаратов и не требует специального оборудования. Но именно из-за кажущейся простоты в нём накапливаются ошибки — от плотности инокулюма до угла, под которым читают чашку.

Ниже — практическая выжимка из действующих российских рекомендаций: что делать на каждом этапе и где чаще всего ошибаются.

Какой документ действует сейчас

Рекомендации МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», версия 2024-02. Они гармонизированы с EUCAST и подготовлены НИИ антимикробной химиотерапии Смоленского медуниверситета совместно с НИИ детских инфекций ФМБА, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера и другими профильными центрами.

Методические указания МУК 4.2.1890-04, на которые до сих пор ссылаются многие внутренние инструкции, формально не отменены, но практическим документом быть перестали: они выпущены в 2004 году и не учитывают пересмотр категорий чувствительности 2019 года.

Категории S, I, R — и что изменилось

Это место, где чаще всего встречается устаревшая трактовка. Категория I больше не означает «промежуточный».

• Ч (S) — чувствительный при стандартном режиме дозирования: высокая вероятность эффективности терапии при обычных дозах.
• У (I) — чувствительный при увеличенной экспозиции: препарат работает, если увеличить дозу, сократить интервал введения, изменить путь введения или продлить инфузию. Это рабочая категория, а не серая зона.
• Р (R) — резистентный: высокая вероятность неудачи даже при увеличенной экспозиции.

Важная деталь: для препаратов, экспозицию которых нельзя значимо увеличить, категории «У» («I») просто не существует.

Питательная среда

Агар Мюллера-Хинтон (МХ) — для бактерий с обычными питательными потребностями. Для прихотливых — агар МХ-П: МХ с добавлением 5% механически дефибринированной лошадиной крови и 20 мг/л β-НАД. На МХ-П работают со стрептококками, включая пневмококк, гемофилами, моракселлой, листерией, кампилобактерами, коринебактериями.

• Толщина слоя агара — 4 ± 0,5 мм. Это примерно 25 мл на чашку 90 мм, 31 мл на 100 мм, 71 мл на 150 мм, 40 мл на квадратную 100×100 мм.
• pH среды — 7,2–7,4, проверяется поверхностно-активным электродом.
• Хранение готовых чашек — при 4–8 °C.
• Перед посевом поверхность агара должна быть сухой: ни капель на агаре, ни конденсата на крышке. При необходимости подсушить при 20–25 °C 16–20 часов или при 35 °C с открытыми крышками 15 минут. Пересушивать нельзя.

Избыточная влажность даёт нечёткий край зоны и вуалеобразный рост внутри неё — а это уже ошибка интерпретации.

Инокулюм и правило 15–15–15

Суспензию готовят прямым суспендированием колоний в стерильном изотоническом растворе до плотности 0,5 по МакФарланду (допустимый диапазон 0,4–0,6), что примерно соответствует 1–2 × 10⁸ КОЕ/мл для E. coli. Колонии берут с неселективного агара после 16–20 часов роста, желательно несколько морфологически одинаковых, чтобы не выхватить атипичный вариант.

Плотность критична напрямую: суспензия гуще нормы даёт зону меньше реальной, жиже — больше. То есть ошибка в мутности превращается в ошибку категории.

Исключение: для S. pneumoniae с шоколадного агара плотность доводят до 1,0 (0,9–1,1) по МакФарланду.

Правило 15–15–15 — три интервала, которые нельзя растягивать:

• нанести суспензию на агар в течение 15 минут после её приготовления;
• наложить диски в течение 15 минут после инокуляции;
• поставить в термостат в течение 15 минут после наложения дисков.

Предельный срок от приготовления суспензии до посева — 60 минут. Задержка перед инкубацией даёт преддиффузию антибиотика и завышенные зоны.

Посев и наложение дисков

• Тампон с суспензией отжимают о стенку пробирки при работе с грамотрицательными и не отжимают с грамположительными.
• Штрихуют в трёх направлениях, следя, чтобы между штрихами не оставалось промежутков. С грамположительными за плотностью штрихов следят особенно.
• На чашку 90 мм — не более 6 дисков, на чашку 150 мм — не более 12. Иначе зоны перекрываются и точно измерить их нельзя.
• Контакт диска с агаром должен быть полным и плотным. Передвигать диск после касания нельзя — диффузия начинается сразу.
• Для выявления индуцибельной устойчивости к клиндамицину диски с эритромицином и клиндамицином располагают на расстоянии 12–20 мм между краями для стафилококков и 12–16 мм для стрептококков.

Хранение дисков — недооценённая причина ошибок

Снижение активности препарата в диске уменьшает зону подавления, и это одна из самых распространённых ошибок метода. Изолят выглядит устойчивее, чем есть.

• Хранить в закрытых сухих контейнерах с индикаторным влагопоглотителем, защищёнными от света. Метронидазол, хлорамфеникол и фторхинолоны инактивируются при длительном освещении.
• Не вскрывать картриджи и контейнеры, пока они не достигли комнатной температуры, иначе на дисках образуется конденсат.
• Амоксициллин-клавуланат, цефаклор и карбапенемы менее стабильны и могут требовать особых условий.
• После вскрытия упаковки использовать в срок, указанный производителем. По истечении срока годности — уничтожать.

Инкубация

Для Enterobacterales, Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Staphylococcus и Enterococcus — 35 ± 1 °C, обычная атмосфера, 18 ± 2 часа. Для энтерококков с гликопептидами — 24 часа: резистентные колонии могут проявиться только к этому сроку.

Для прихотливых — стрептококков, пневмококка, гемофил, моракселлы, листерии — 35 ± 1 °C в атмосфере с 4–6% CO₂, 18 ± 2 часа.

Чашки переворачивают дном кверху и убеждаются, что диски не отваливаются. В стопке оптимально пять чашек — больше даёт неравномерный прогрев.

Продлевать инкубацию сверх рекомендованной нельзя: внутри зоны появляется рост, и изолят ошибочно оценивают как резистентный.

Как измерять зоны

Ориентируются на зону полного подавления роста, определяемую невооружённым глазом с расстояния около 30 см. Чашку удобно наклонить под углом 45° к рабочей поверхности.

• На агаре МХ без добавок — чашка дном кверху, крышка закрыта, над тёмной матовой поверхностью, в отражённом свете.
• На агаре МХ-П — чашка дном книзу, крышку снимают, тоже в отражённом свете.
• Измеряют с точностью до миллиметра линейкой или штангенциркулем.
• Учитывать результат в проходящем свете или через увеличительное стекло нельзя.
• Автоматические анализаторы должны быть калиброваны по визуальному учёту.

Сложные случаи

• Колонии внутри зоны. Сначала убедиться в чистоте культуры. Если культура чистая — колонии учитывают при измерении диаметра.
• Двойная зона. Проверить чистоту культуры, измерять по внутреннему краю.
• Proteus spp. Роение внутри зоны во внимание не принимают, читают по краю зоны подавления.
• Нечёткий край у Enterobacterales и Staphylococcus — по внутреннему краю наименее заметного роста. Чашку держат над тёмной поверхностью, к свету не подносят.
• S. pneumoniae. Мелкие колонии, видимые с 30 см при наклоне 45°, учитывают. Их появление у края зоны часто говорит о переувлажнённом агаре МХ-П.

Отдельный признак, который стоит знать: если вместо сплошного газона выросли отдельные колонии, значит суспензия была недостаточной плотности, и исследование надо повторить. Края зон должны быть ровными, не зубчатыми, и иметь форму окружности.

Контроль качества

Контроль проводят с использованием контрольных штаммов, оптимально — ежедневно, как минимум для антибиотиков из стандартных наборов.

• При накоплении 10 и более результатов по паре «штамм — антибиотик» среднее значение диаметра зоны должно быть близко к целевому, оптимально в пределах ± 1 мм.
• Расширенную программу — выявление ESBL, MRSA, VRE, HLGR и мутаций ПСБ — выполняют при смене партии дисков или среды и, кроме того, ежемесячно.
• Контроль ингибирующего компонента дисков с комбинациями бета-лактамов и ингибиторов требует специальных штаммов-продуцентов бета-лактамаз и должен быть частью повседневной программы.

Где взять пограничные значения

Сами таблицы пограничных значений диаметров зон по группам возбудителей приведены в разделе 2 рекомендаций МАКМАХ. Мы намеренно не дублируем их у себя: EUCAST пересматривает значения ежегодно, и копия быстро устаревает. Пользуйтесь первоисточником.

Скачать действующую версию рекомендаций МАКМАХ — на сайте Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии, бесплатно.

Диски с антибиотиками для постановки метода — в нашем каталоге: более 200 наименований в наличии.